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三叉神经痛大鼠模型中CB1受体的表达变化

时间:2017-03-15 12:34  来源:未知  阅读次数: 复制分享 我要评论

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摘  要

1、背景
大麻类植物是人类最早认识的成瘾性植物之一,用大麻止痛的记载可追溯到数百年前。近十几年,随着内源性大麻素(anandamide)的发现,两种内源性大麻素受体(CB1和CB2)的成功克隆,内源性大麻素递质系统的存在已被初步证实。CBl、CB2受体都属于G蛋白偶联受体,CBl受体由473个氨基酸,7个跨膜结构域构成。研究发现CBl受体主要分布于神经系统,以脑组织中表达为主,集中分布在大脑的海马、小脑和纹状体,多定位于神经末梢突触前膜,发挥调节神经递质释放的作用。在肾上腺,心脏,肺,前列腺,脾脏和扁桃体等外周组织中也有微量表达。CB2受体由360个氨基酸,7个跨膜结构域构成,与CB1受体相反,CB2受体在中枢神经元中浓度很低,主要在免疫系统包括脾、扁桃体、单核细胞、T细胞和B细胞中表达,主要发挥免疫调节作用,并能够抑制多种细胞因子的释放。有报道指出 CB1受体的激动剂可以产生很好的镇痛效应且抑制疼痛神经元的兴奋性。其次,CB1受体的拮抗剂可以增强疼痛性神经元的活性,并且增强对有害刺激的敏感性。CB1受体可抑制伤害性疼痛,减少自发性疼痛的相关行为。
三叉神经痛(Trigeminal neuralgia,TN)是指在三叉神经分布区域内出现阵发性电击样剧烈疼痛,历时数秒至数分钟,间歇期无症状。疼痛可由口腔或颜面部的任何刺激引起。以中老年人多见,多数为单侧性。到目前为止,TN的发病机制仍不明了,确切的动物模型还难以建立。国内外学者普遍认为周围因素是TN的主要致病因素,周围因素中的血管压迫学说获得绝大部分学者的认同,因此,动物模型大多是通过结扎眶下神经模拟血管压迫,并在眶下神经支配处表面皮肤进行机械刺激,模拟三叉神经痛扳机点。
三叉神经脊束核(Spinal trigeminal caudal subnucleus,Vc)位于延髓的外侧及三叉神经脊束的内侧,从外到内有五层。三叉神经脊束核是颌面部组织伤害性刺激向中枢传导的第一门户,尾侧亚核和相邻的区域是感受躯体感觉的初级中枢,传递着颌面部的伤害性刺激信息。Vc尾侧亚核在细胞构筑上相当于脊髓后角Ⅰ~Ⅵ层。Vc被认为是面部伤害性传导通路的二级神经元所在,与痛觉冲动的传递和调制有密切关系。VcⅡ层中胶状质中间神经元发生变性,丧失了对传入的疼痛刺激的调节作用,即失去了对传入冲动的闸门作用,使传入冲动很快达到总和而引起疼痛的发作。因此我们采用Vc组织来检测CB1受体的表达变化。
研究表明,在外周神经损伤之后,大鼠和猴的背根神经节神经元和脊髓中μ-阿片受体的表达降低。与之相反,在单侧神经损伤后,对侧丘脑区域的CB1受体上调,且在坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)大鼠的同侧背角的表浅脊髓中其表达亦上调。Nomura等和我们的研究团队的研究也表明,在单侧下牙槽神经横断的大鼠中,在对其鼻口部进行有害和无害的刺激之后,在双侧Vc中均可诱导Fos和cdk5/p35蛋白样免疫反应性,但是在横断的同侧大于对侧。Vc作为感觉中继站核,分别接受经三叉神经传入的头面部感觉信息。CCI之后CB1受体上调的细胞分子生物学机制尚不明确。在坐骨神经CCI的模型中,酪氨酸激酶受体和相关的细胞内丝裂原活化蛋白激酶以及蛋白激酶C可能参与CCI之后脊柱CB1受体的调控。眶下神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury on the infraorbital branch of the trigeminal nerve, ION-CCI)大鼠模型的病理学特征同所描述的坐骨神经CCI之后的损伤非常相似。
综合上述的研究背景,本实验制备了三叉神经痛大鼠模型并检测了各组三叉神经痛大鼠模型Vc组织中CB1受体的表达变化。
2、目的
我们假设CB1受体存在于大鼠TN模型Vc内的神经元中,由于尚无CB1受体在该模型中如何发挥作用方面的阐述,而且三叉神经的感觉神经传入延髓下段的Vc神经元,因此我们考虑将眶下神经慢性缩窄性伤害的大鼠作为TN的实验研究模型,检验ION- CCI后大鼠Vc组织中CB1受体的表达变化,为研究CB1受体与TN发病机制和临床治疗的关联性打下实验基础。
3、材料与方法
3.1 实验动物分组
同一批次健康成体雄性SD大鼠,体重为300~350g,36只随机分为6组,每组6只。分为正常组、假手术组、ION-CCI 1d组、ION-CCI 3d组、ION-CCI 7d组、ION-CCI 14d组。大鼠由南方医科大学珠江医院动物实验室以常规固体饲料饲养,温度控制在22-25℃,湿度在40%~50%之间,12h明暗循环(07:00—19:00)。为了消除因为动物行为的随意性对实验过程和结果的干扰,减少由此引起的假阳性结果,在实验开始之前每日 08:00 开始,用一自制塑料棒敲击笼壁四周和笼顶、触摸、提拿大鼠,于大鼠习惯之后,待大鼠平静时,用一自制毛刷刺激大鼠须垫部,3次/每侧,每次刺激需连续2次,两次刺激间隔不应少于 30 秒。两侧交替进行,直致大鼠从开始的抽鼻、探究、恐惧,甚至快速后退逃避、抓咬攻击等转为平静。
3.2 暴露并行眶下神经结扎术
实验动物以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔内注射麻醉效果满意后,大鼠仰卧固定四肢,于大鼠口腔内,沿着大鼠右侧龈颊侧边缘,平大鼠右侧第一磨牙水平,向其口鼻方向纵向切开长约1cm的切口,稍加分离即可暴露眶下神经(infraorbital branch of the trigeminal nerve, ION),再分离ION周围约5mm组织,用两根5.0铬制肠线疏松环扎ION,两根铬制肠线相距2mm,环扎松紧度要求在肉眼或显微镜下仅缩小ION直径,以达到延迟神经传导,但又不能够完全阻滞神经表层血管的血液传导,血液循环必须通畅。术后6.0缝合线缝合伤口。假手术组大鼠除不结扎ION外,其他方面与手术组大鼠完全相同。所有操作均需在无菌环境下进行,手术前后无需使用任何抗生素。
3.3 测得各实验组大鼠对电子VON FERY测痛仪所产生机械刺激的反应阈值。
3.4 眶下神经标本及Vc组织标本的制取
根据分组标志分别称取大鼠体重,按体重腹腔注10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,取结扎区ION进行weil氏和HE染色观察。根据Watson和Paxinos的大鼠脑立体定位图谱定好Vc组织坐标位置后切取大鼠Vc组织块,分别放入相应标记好的试管中,放入-80℃冰箱冷冻储存。
3.5 Vc组织抗原蛋白的提取
按照标记试管取出Vc组织块用PBS液冲洗,将Vc组织放置于冰上用干净的剪刀尽量剪碎,再将其放入匀浆器内,每5mg加入300μl配制好的细胞裂解缓冲液后,裂解30min后,用移液枪移至1.5ml离心管中,然后在4℃下,12000rpm  离心5min,提取其上清液装于已经标记好的离心管中,再放入-20℃冰箱中保存备用。
3.6 Vc组织上清液蛋白含量的测定
3.7 CB1受体的Western blotting检测
4、统计方法与统计软件
实验数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,结果用均数±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和重复测量方差分析(Repeated Measures),先进行方差齐性检验,如方差齐性,则用Bonferroni检验进行多重比较,如方差不齐,则用Dunnett’s进行多重比较,P<0.05表示差异有统计学意义。两组间比较用配对样本t检验分析(Paired-Samples T Test),P<0.05表示差异有统计学意义。
5、结果
(1)行为学观察结果显示,正常组和假手术组每天疼痛阈值比较并无显著差异,P均大于0.05。手术组和对照组比较术后疼痛阈值具有显著差异,P均小于0.05。
(2)组织学观察结果显示:术后缩窄环区域神经纤维肿胀逐渐明显; 神经纤维变性、大小不一、髓鞘增厚、 板层松解,髓鞘空泡样变性,轴突裸露,雪旺氏细胞增生明显;纵断面切片可以看到髓鞘呈虫蚀状局灶性断裂缺失,轴突稀疏,处于偏心位置,连续性中断,正常结构消失。
(3)CB1受体在ION-CCI 1d组、ION-CCI 3d组、ION-CCI 7d组和ION-CCI 14d组大鼠Vc组织中的含量表达依次上调,但正常组和假手术组大鼠Vc组织中CB1受体含量表达无显著性差异;假手术组大鼠手术侧与对侧Vc组织中CB1受体含量表达无差异;ION-CCI 14d组手术侧与对侧Vc组织中CB1受体含量表达有显著差异。
6、结论
(1)外周神经损伤可呈时间依赖的形式导致Vc组织中CB1受体表达上调。
(2)ION-CCI后诱导了其同侧和对侧CB1受体表达增加,在CCI侧CB1受体表达上调的程度显著大于其对侧。
(3)CB1受体表达变化与周围神经疼痛阈值变化无直接关联。
 
关键词  三叉神经痛  CB1受体  慢性压迫性损伤
 
 
 

目  录
 
摘  要 I
ABSTRACT i
前  言 1
第一部分  三叉神经痛大鼠模型建立及行为学组织学观察 4
1、材料与方法 5
2、结果 10
3、讨论 16
参考文献 21
第二部分  各实验组大鼠Vc组织中CB1受体的表达变化 26
1、材料与方法 27
2、结果 38
3、讨论 42
参考文献 44
全文总结 47
攻读学位期间成果 49
中英文对照缩略词表 50
致  谢 51
南方医科大学学位论文原创性声明 52
统计学证明 53
 
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